BSISO13125:2013精细陶瓷（高级陶瓷、高级技术陶瓷）一半导体光催化 材料的抗真菌活性试验方法 作业指导书 1. 目的 为确保《BSISO13125:2013精细陶瓷（高级陶瓷、高级技术陶瓷）一半导体光催 化材料的抗真菌活性试验方法》试验顺利进行，规范试验操作过程，保证试验结果准确。 2.范围 本标准规定了一种测试方法，通过计算预培养真菌孢子在紫外线(UV-A)照射下存活 的数量，来测定含有光催化剂或表面有光催化膜的材料的抗真菌活性。标准用于对各种 应用材料进行评估，如：平面涂料、薄板、木板或板材形式的材料，但不包括粉末、颗 粒状、纤维状或多孔的光催化材料。 3.原理 通过定量接种试验真菌于2组对照样品和试验样品上，用贴膜的方法使接种菌均匀 地接触试样，其中1组对照样品和试验样品置“光条件”下培养，另外1组对照样品和试 验样品置“暗条件”下培养，经过接触作用一定的时间后，通过检测在两种作用条件下的 试验样品与对照样品中的存活菌数来计算出试验样品的抗真菌活性值及在紫外线照射 下光贡献的抗真菌活性值。 4.测试菌种 4.1黑曲霉WDCM00144=泡盛曲霉ATCC6725； 4.2嗜松青霉WDCM00194。 注：试验真菌应从国家或国际菌种管理库中获得。 5.设备、培养基、试剂和耗材 5.1设备： 5.1.1恒温恒湿箱：28℃±1℃；90%±2%RH; 5.1.2生物安全柜； 5.1.3恒温水浴锅：40-50℃； 5.1.4黑光蓝灯（BLB灯）：峰值波长为351nm： 5.1.5照度计； 5.1.6显微镜； 5.1.7涡流混合器； 5.1.8超声振动仪； 5.1.9光照设备（6.5）； 5.1.10高温高压灭菌锅。 5.2培养基与试剂： 5.2.1马铃薯葡萄糖琼脂(简称PDA)； 5.2.2制备菌悬液、洗脱回收、稀释孢子的溶液：将0.05g二辛基琥珀酸钠和9g氯化钠 加入至1000mL的去离子水中，充分溶解混匀后将该溶液置高温高压灭菌器中灭菌（可 按实际情况，配制所需的容量，如将溶液分装到试管中，每管9.0mL0.1mL）。 5.3耗材： 5.3.1移液枪和无菌枪头：10mL；1000uL；200uL； 5.3.2无菌镊子； 5.3.3无菌平皿； 5.3.4无菌均质袋； 5.3.5试管（16x100mm）； 5.3.6接菌环； 5.3.740mm×40mm聚丙烯薄膜； 5.3.8灭菌纱布； 5.3.9无菌玻璃片。 6.试验的准备 6.1试样的裁剪：将试验样品和对照样品裁剪成规格为50mm±2mm(厚度为<10mm)的正 方形。准备对照样品9片，试验样品6片。当不能提供对照样品时，使用玻璃片代替。 注：①避免试样受微生物污染和交叉污染。 ②当很难或不可能将试样切割成长50+2mm(厚度为<10mm)的正方形时，只要试样表面能覆盖400mm²至 1600mm²的薄膜，就可以使用不同尺寸的试样。 ③玻璃片的规格应和试样保持一致。 6.2试样的使用：实验分两种作用条件，分别为“光条件”和“暗条件”。3片试验样品和3 片对照样品用于“光条件”试验，另外3片试验样品和3片对照样品用于“暗条件”试验。 剩余3片对照样品用于接种真菌孢子后立即洗脱测0小时的活菌数。 注：①光条件：是指将含有已接种菌悬液的试样（3片试验样品和3片对照样品）的培养皿暴露在黑光灯下照射 ②暗条件：是指将含有已接种菌悬液的试样（3片试验样品和3片对照样品）的培养血放置在黑暗处。 6.3试样的清洗与消毒：用80%酒精棉球试样表面，并擦拭在24h内用强度为0.8mW/cm 的紫外灯照射试样表面（在不影响试样抗菌性能的前提下，与委托方沟通后选择适宜的 消毒方式）。 6.4设置作用温度和确定作用位点：实验前将培养箱的温度调整至25土5℃并设置好黑光 灯的位置，提前15min开启黑光灯，待光源稳定后，使用照度计测定培养箱各点的紫外 线强度并选择适合试样放置的位置。 6.5确定作用时间和光照强度：试样在光照设备中可接受的最大光照强度为0.8mW/cm²， 照射时间可为3h-24h。紫外线照射条件应根据实际产品在使用时所处的环境表面的光照 强度来设置，一般设置范围为0.4mW/cm²-0.8mW/cm²，因为真菌孢子比细菌更耐光催 化作用(参见ISO27447)。“暗条件"试验中的试样应与"光条件"保持在相同时间、相同温 度下培养。 6.6试验菌种培养物的准备：菌种提前用PDA活化转接，储备菌株保存在冰箱中不得超 过3个月，传代培养的菌株则保存在冰箱中不得超过10天。 7.测试流程 7.1孢子菌悬液的制备： 将适量的稀释液（5.2.2）倒入传代培养的菌株斜面管中，用接种环轻轻地刮下孢子， 用两层纱布过滤抱子悬浮液，然后用涡流混合器将滤液振荡混匀。对于黑曲霉，用超声 振动仪(30kHz-50kHz，5min)分散孢子。用血球计数方法计算出孢子数，然后将孢子悬 液按比例稀释至5.0×10°spores/mL左右。孢子菌悬液在5℃-10℃下最多可保存24小时。 7.2测定孢子菌悬液的活菌数： 通过10倍梯度稀释，使用平板倾注法测定孢子菌悬液的活菌数。吸取1mL孢子菌 悬液加入装有9.0mL0.1mL稀释液的试管中，振荡摇匀后，继续10倍梯度稀释，然 后每个稀释梯度分别吸取1mL的菌液滴加到两个无菌平血中。向加有菌液的无菌平血 中倒入15-20mL在45℃-48℃温度下保存的PDA培养基，轻轻摇匀。琼脂培养基应在 室温下至少固化15min。然后将平板置于26℃±1℃的培养箱中，培养7天。菌落计数范 围为10-99spores，记录可数平板的稀释倍数。 7.3试样在无菌平血中的布置： 如下图所示，培养皿的底部放置一张保湿滤纸，在滤纸中加入适量的无菌水(5-7 mL)，然后放入玻璃管或玻璃棒。 注：除了试样和薄膜，其余玻璃耗材都要用高温高压灭菌法灭菌。 注: 1聚丙烯薄膜 2．试样 3.孢子悬液 4.玻璃面板 5.平皿（无菌） 6.滤纸 7.玻璃棒，玻璃管 7.4接种孢子菌悬液： 在试样中心接种0.1mL孢子菌悬液（7.1），然后用40mm×40mm的薄膜覆盖。通 过覆盖薄膜，使菌液在试件和薄膜之间均匀散开。应注意，不能让菌液漏出薄膜外面。 注：由于孢子在多孔或粗糙表面上不会均匀分散，所以这种类型的接种只适用于平面试样。 7.5测定3片对照样品0小时的活菌数： 在6.2中描述的用于测定0小时活菌数的3片对照样品在接种后立即转移至无菌均 质袋中，然后加入10mL的洗脱液，用手揉捏均质袋至少10次使接种菌液充分脱离试 样并在洗脱液中均匀分布。振荡摇匀后按7.2的方法测定洗脱液的活菌数。 注：在试验前，建议验证已接种试样的孢子回收率是否大于90%。 7.6将剩余的试样如6.2中描述的分为两部分，一部分为“光条件"试验，另一部分为“暗 条件"试验。用于“光条件"试验的试样放置在6.4和6.5所描述的光照设备中，如下图所 示。试样在“光条件”试验的过程中，黑光灯应保持打开，作用温度为25土5℃，作用时间 为3h-24h；用于“暗条件"试验的试样应放置在无光源的培养箱中，作用温度和培养时间 应与“光条件”试验中的一样。 1.聚丙烯薄膜 2.试样 3.孢子悬液 4.玻璃面板 5.平皿（无菌） 6.黑光灯 7.7测定3片试验样品和3片对照样品作用后的活菌数： 用无菌镊子将作用后的试样转移至无菌均质袋中，然后加入10mL洗脱液，用手揉 捏均质袋至少10次使接种菌液充分脱离试样并在洗脱液中均匀分布。振荡摇匀后按7.2 的方法测定洗脱液的活菌数。 8.计算和评价 注：根据IEC60068-2-10，计算值通常四舍五入至小数点后第二位。 8.1计算孢子浓度： S=K×D 式中： S：孢子浓度（spores/mL）； K：平均孢子数（spores）； D：稀释因子。 8.2计算孢子存活数： F=SxV 式中： F：孢子存活数（spores）； S：孢子浓度(spores/mL); V：洗脱液的体积(mL)。 8.3试验的有效性： 8.3.1在7.5和7.7中，真菌孢子分散充分且均匀。 8.3.2未处理试样接种后的平均孢子数（A）应在1.0x10*spores-1.0x10’spores范围内 8.4在光照强度为L条件下的抗真菌活性值（RL）： RL=[log(BL / A)-log(CL / A)J=log(BL /CL) 式中： RL：光照强度为L条件下的抗真菌活性值 L：紫外线照射强度(mW/cm²) A：未处理试样接种后的平均孢子数； BL：未处理试样在“光条件"试验中作用数小时后存活孢子数的平均值； CL：经光催化处理试样在“光条件”试验中作用数小时后存活孢子数的平均值。 注：将数值计算到小数点后两位，然后删除第二位小数保留小数点后一位。 8.5紫外线照射下光贡献的抗真菌活性值（△R）： △R=RL-log(Bp / CD) 式中： R：紫外线照射下光贡献的抗真菌活性值； BD：未处理试样在“暗条件"试验中作用数小时后存活孢子数的平均值； CD：经光催化处理试样在“暗条件”试验中作用数小时后存活孢子数的平均值。 9.报告 9.1经光催化处理试样和未处理试样的描述（材料、尺寸）； 9.2使用的紫外线光源（厂家、型号）； 9.3试样前处理照射的条件（光照强度、作用时间）； 9.4使用的紫外线照度计（厂家、型号）； 9.5使用的覆盖膜和玻璃平板的类型（厂家、型号）； 9.6“光条件”试验的作用条件（光照强度L、作用时间）； 9.7孢子菌悬液的接种体积（mL）； 9.8使用的真菌菌种（菌种名称和菌种编号）； 9.9试验结果：A值、BL